Fluorescencinis filtras yra esminis fluorescencinio mikroskopo komponentas.Įprastoje sistemoje yra trys pagrindiniai filtrai: sužadinimo filtras, emisijos filtras ir dichroinis veidrodis.Paprastai jie supakuoti į kubą, kad grupė būtų įterpta į mikroskopą.
Kaip veikia fluorescencinis filtras?
Sužadinimo filtras
Sužadinimo filtrai perduoda tam tikro bangos ilgio šviesą ir blokuoja kitus bangos ilgius.Jie gali būti naudojami skirtingoms spalvoms gaminti, sureguliuojant filtrą, kad būtų galima pernešti tik vieną spalvą.Sužadinimo filtrai būna dviejų pagrindinių tipų – ilgo pralaidumo filtrai ir juostos pralaidumo filtrai.Sužadintuvas paprastai yra juostos pralaidumo filtras, kuris praleidžia tik fluoroforo sugertus bangos ilgius, taip sumažindamas kitų fluorescencijos šaltinių sužadinimą ir blokuodamas sužadinimo šviesą fluorescencinės emisijos juostoje.Kaip parodyta mėlyna linija paveikslėlyje, BP yra 460–495, o tai reiškia, kad jis gali praeiti tik per 460–495 nm fluorescenciją.
Jis dedamas į fluorescencinio mikroskopo apšvietimo kelią ir filtruoja visus šviesos šaltinio bangos ilgius, išskyrus fluoroforo sužadinimo diapazoną.Minimalus filtro perdavimas diktuoja vaizdų ryškumą ir blizgesį.Rekomenduojamas bent 40 % bet kurio sužadinimo filtro perdavimas, kad idealiu atveju transmisija būtų > 85 %.Sužadinimo filtro juostos plotis turi būti visiškai fluoroforo sužadinimo diapazone, kad filtro centrinis bangos ilgis (CWL) būtų kuo artimesnis didžiausiam fluoroforo sužadinimo bangos ilgiui.Sužadinimo filtro optinis tankis (OD) diktuoja fono vaizdo tamsumą;OD yra matas, nurodantis, kaip gerai filtras blokuoja bangos ilgius, esančius už perdavimo diapazono arba juostos pločio.Rekomenduojamas minimalus OD yra 3,0, tačiau idealus yra 6,0 ar didesnis OD.
Emisijos filtras
Emisijos filtrai yra skirti leisti norimai mėginio fluorescencijai pasiekti detektorių.Jie blokuoja trumpesnius bangos ilgius ir turi didelį pralaidumą ilgesniems bangų ilgiams.Filtro tipas taip pat susietas su skaičiumi, pvz., paveiksle BA510IF (interferencinis barjerinis filtras), šis žymėjimas nurodo bangos ilgį esant 50 % didžiausio perdavimo.
Tos pačios rekomendacijos dėl sužadinimo filtrų galioja ir emisijos filtrams: minimalus perdavimas, dažnių juostos plotis, OD ir CWL.Emisijos filtras su idealiu CWL, minimaliu perdavimo ir OD deriniu suteikia ryškiausius įmanomus vaizdus su giliausiu blokavimu ir užtikrina silpniausių emisijos signalų aptikimą.
Dichroinis veidrodis
Dichroinis veidrodis yra tarp sužadinimo filtro ir emisijos filtro 45° kampu ir atspindi sužadinimo signalą link fluoroforo, tuo pačiu perduodant emisijos signalą į detektorių.Idealūs dichroiniai filtrai ir pluošto skirstytuvai turi aštrius perėjimus tarp maksimalaus atspindžio ir maksimalaus perdavimo, sužadinimo filtro juostos pločio atspindys yra >95%, o emisijos filtro pralaidumas yra >90%.Pasirinkite filtrą atsižvelgdami į fluoroforo susikirtimo bangos ilgį (λ), kad sumažintumėte išsklaidytą šviesą ir padidintumėte fluorescencinio vaizdo signalo ir triukšmo santykį.
Šiame paveiksle esantis dichroinis veidrodis yra DM505, taip pavadintas dėl to, kad 505 nanometrai yra bangos ilgis esant 50 % didžiausio šio veidrodžio pralaidumo.Šio veidrodžio perdavimo kreivė rodo didelį pralaidumą virš 505 nm, staigų pralaidumo sumažėjimą į kairę – 505 nanometrus, o maksimalų atspindį – į kairę – 505 nm, tačiau vis tiek gali būti, kad pralaidumas mažesnis nei 505 nm.
Kuo skiriasi ilgojo ir juostos pralaidumo filtrai?
Fluorescencinius filtrus galima suskirstyti į du tipus: ilgo pralaidumo (LP) ir juostos pralaidumo (BP).
Ilgo pralaidumo filtrai perduoda ilgus bangos ilgius ir blokuoja trumpesnius.Ribinis bangos ilgis yra 50 % didžiausio perdavimo bangos ilgis, o visi bangos ilgiai, viršijantys ribą, perduodami ilgo pralaidumo filtrais.Jie dažnai naudojami dichroiniuose veidrodžiuose ir emisijos filtruose.Ilgojo pralaidumo filtrai turėtų būti naudojami, kai taikant reikia surinkti didžiausią emisiją ir kai spektrinė diskriminacija nepageidautina arba nebūtina, o tai paprastai būdinga zondams, kurie sukuria vieną skleidžiančią rūšį mėginiuose su santykinai žemu fono autofluorescencijos lygiu.
Juostos pralaidumo filtrai perduoda tik tam tikrą bangos ilgio juostą, o blokuoja kitas.Jie sumažina skersinį pokalbį leisdami perduoti tik stipriausią fluoroforo emisijos spektro dalį, sumažina autofluorescencinį triukšmą ir taip pagerina signalo ir triukšmo santykį didelio fono autofluorescenciniuose mėginiuose, kurių negali pasiūlyti ilgo pralaidumo filtrai.
Kiek rūšių fluorescencinių filtrų rinkinių gali tiekti BestScope?
Kai kurie įprasti filtrų tipai yra mėlyni, žali ir ultravioletiniai filtrai.Kaip parodyta lentelėje.
| Filtrų rinkinys | Sužadinimo filtras | Dichroinis veidrodis | Barjerinis filtras | LED lempa bangos ilgis | Taikymas |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: fluorescencinių antikūnų metodas ·Acidino oranžinė: DNR, RNR ·Auraminas: tuberkuliozės bacila · EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | 570 DM | BA575 | 535 nm | · Rodaminas, TRITC: fluorescencinių antikūnų metodas ·Propidžio jodidas: DNR · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Automatinio fluorescencijos stebėjimas · DAPI: DNR dažymas · Hoechest 332528, 33342: naudojamas chromosomų dažymui |
| V | 400-410 BP | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katecholaminai · 5-hidroksi triptaminas ·Tetraciklinas: skeletas, dantys |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filtrų rinkiniai, naudojami fluorescencijai gauti, yra sukurti pagal pagrindinius bangos ilgius, naudojamus fluorescencijos programose, o tai pagrįsta dažniausiai naudojamais fluoroforais.Dėl šios priežasties jie taip pat pavadinti fluoroforo, skirto vaizdavimui, vardu, pavyzdžiui, DAPI (mėlynas), FITC (žalias) arba TRITC (raudonas) filtrų kubeliai.
| Filtrų rinkinys | Sužadinimo filtras | Dichroinis veidrodis | Barjerinis filtras | LED lempa bangos ilgis |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auraminas | 470 BP | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Teksaso raudona | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Kaip pasirinkti fluorescencinį filtrą?
1. Fluorescencinio filtro pasirinkimo principas yra leisti fluorescencinei / emisijai šviesai prasiskverbti per vaizdo galą ir tuo pačiu metu visiškai blokuoti sužadinimo šviesą, kad būtų pasiektas didžiausias signalo ir triukšmo santykis.Ypač taikant daugiafotonų sužadinimo ir viso vidinio atspindžio mikroskopą, silpnas triukšmas taip pat sukels didelių trikdžių vaizdo efektui, todėl signalo ir triukšmo santykio reikalavimas yra didesnis.
2. Žinoti fluoroforo sužadinimo ir emisijos spektrą.Norint sukurti fluorescencinių filtrų rinkinį, generuojantį aukštos kokybės, didelio kontrasto vaizdą juodame fone, sužadinimo ir emisijos filtrai turėtų pasiekti aukštą pralaidumą su minimaliu pralaidumo juostos virpėjimu regionuose, kurie atitinka fluoroforo sužadinimo smailes arba emisijas.
3. Atsižvelkite į fluorescencinių filtrų patvarumą.Šie filtrai turi būti nepralaidūs intensyviems šviesos šaltiniams, kurie generuoja ultravioletinę (UV) šviesą, kuri gali sukelti „perdegimą“, ypač žadintuvo filtrą, nes jį veikia visas apšvietimo šaltinio intensyvumas.
Įvairūs fluorescenciniai pavyzdiniai vaizdai
Ištekliai renkami ir tvarkomi internete ir naudojami tik mokymuisi ir bendravimui.Jei yra kokių nors pažeidimų, susisiekite su mumis, kad pašalintume.
Paskelbimo laikas: 2022-12-09